10.26-qPCR引物设计

设计原则：

1.PCR扩增产物长度 :80-150bp. 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长至300 bp）

2.引物长度一般在15-30碱基之间。
　　引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。Tm=58-60度。
　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3'端不能选择A，最好选择T。
　　引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。

5.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

设计步骤：

获得基因序列后，打开primer 5.0

1.点击File-new-DNA sequence 粘贴cDNA序列-as is-ok

2.点search-调整如图参数（产物长度一般为100-300，引物长度一般为20左右，视情况调整）

3.弹出下图窗口后，先看右边，根据系统设计的引物进行筛选，优先评分较高的

S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看

• ΔG绝对值小于10
• tm在58左右，正负2度
• GC%在40%-60%
• 末端不能是A
• 不能有连续3个相同的碱基
• 3’端一定不能有错配

【筛选原则】：

1. 最好hairpin, dimer, false priming 没有
2. 最好是没有连续相同碱基，如TTT、GGG
3. 最好两个引物之间bp之差小于等于2，
4. 产物长度大于100，小于300最好，也可以到400
5. tm在58左右，正负2度
6.一般设计时引物18-22长度，最长不要超过25 
7.3’不能以A结尾
8.出现Found时，ΔG绝对值小于10
4.以系统给出的第一对引物为例（看框住的地方），虽然系统给出的评分比较高，但是下游引物可能出现发夹结构（Hairpin）和二聚体（Dimer）,我们可以尝试调整一下。

弹出如下窗口后，光标点在①号位置，删除几个碱基后，
点击②号位置Analyze,点击③号位置ok